由蠟樣芽孢桿菌引起的細(xì)菌性白斑病是凡納濱對(duì)蝦半精養(yǎng)出現(xiàn)的新型疾病

　　S. Velmurugan（印度，2015年）

　　摘要
     
　　在印度南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)在正面臨著一個(gè)嚴(yán)重的新型細(xì)菌病，即白斑病（WPD）。感染疾病后，死亡率隨著感染天數(shù)逐漸增加。但是一旦嚴(yán)重的疾病暴發(fā)來(lái)臨，養(yǎng)殖場(chǎng)南美白對(duì)蝦的死亡率在3-5天內(nèi)將超過(guò)70%，主要癥狀是頭胸甲上有不透明的白色斑塊、壞死、體色淡藍(lán)、食欲不振、肌肉發(fā)白。對(duì)染病的蝦進(jìn)行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)病原體是桿狀菌。基因組鑒定證實(shí)，WPD的致病病原菌為蠟樣芽孢桿菌（GenBank登錄號(hào)：KF673474.1）。引起WPD的蠟樣芽孢桿菌具有較高的致病因子包括溶血活性、脂肪酶活性。南美白對(duì)蝦和鹵蟲在細(xì)菌濃度為10的4次方到8次方cfu/mL時(shí)，死亡率較高。
 
　　1、前言
     
　　印度的對(duì)蝦產(chǎn)量主要來(lái)源于斑節(jié)對(duì)蝦，2004年產(chǎn)量為125000噸，但2008年迅速下降到75000噸。產(chǎn)量的下降主要是由斑節(jié)對(duì)蝦的繁育和疾病問(wèn)題導(dǎo)致的，且其種質(zhì)的衰退也促使印度政府從太平洋地區(qū)引進(jìn)無(wú)特定病原******的南美白對(duì)蝦。因?yàn)樗粓?bào)道具有高抗病性，高生長(zhǎng)速度，對(duì)高密度的持續(xù)耐受性強(qiáng)，適應(yīng)低鹽低溫(Remany et al., 2010)。養(yǎng)殖戶通過(guò)養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦已經(jīng)取得了巨大成功并獲得了高利潤(rùn)，這使得南美白對(duì)蝦成為了一個(gè)重要的從國(guó)外引進(jìn)的養(yǎng)殖物種（Palanikumar等，2011）。

      不幸的是，在印度的內(nèi)洛爾牛、普拉喀桑縣、Gundur、克里希、西戈達(dá)瓦里河、東戈達(dá)瓦里區(qū)的安得拉邦、納格伯蒂訥姆、Sirkali、Cudalore、韋蘭卡尼、泰米爾納德邦的Pudukottai和Poneri區(qū)，南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)正面臨一個(gè)嚴(yán)重的新型的細(xì)菌性疾病。在對(duì)蝦的養(yǎng)殖過(guò)程中染病后，隨著養(yǎng)殖天數(shù)的增加，死亡率慢慢增加。一旦爆發(fā)，蝦的存活率很低，F(xiàn)CR較高。有時(shí)當(dāng)疾病爆發(fā)后，南美白對(duì)蝦在2-3天內(nèi)會(huì)出現(xiàn)非常嚴(yán)重的死亡，使得養(yǎng)殖戶不得不提前清塘，對(duì)養(yǎng)殖戶造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。最重要的癥狀為：尾部橫紋肌和腹部肌肉組織壞死；壞死的區(qū)域表現(xiàn)為白色不透明的斑塊。之后，白色的斑塊變成黑色斑點(diǎn)或者碎片；蝦體色變成淡藍(lán)色；食欲不振；有時(shí)候體表粗糙，體色變紅或不變色；肌肉發(fā)白。許多死蝦顯示，其外部骨骼完整，但內(nèi)部組織卻缺失了很多，就好像是被吃了或者是內(nèi)部退化造成的。在疾病急性發(fā)生期，南美白對(duì)蝦的死亡率高達(dá)70%。
 
　　組織學(xué)和基因組鑒定結(jié)果表明，該白斑病的病原體為革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌—蠟樣芽孢桿菌。幾個(gè)蠟樣芽孢桿菌菌株已經(jīng)被確定為不同食物中毒類型的病原體(Ehling-Schulz et al., 2004)。目前的工作目的是確定和描述養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦白斑病（WPD）新的細(xì)菌病原體。
 
　　2、材料和方法
 
　　2.1 南美白對(duì)蝦樣品
　　瀕死的蝦來(lái)自安德拉邦的Tanuvtur、Prakasam區(qū)域的半精養(yǎng)蝦場(chǎng)，其死亡是由細(xì)菌感染引起的。瀕死的蝦在無(wú)菌的條件下，用無(wú)菌的聚乙烯袋裝充氧的養(yǎng)殖池塘水，其水溫為26±28°C，在一小時(shí)內(nèi)送到安德拉邦的翁戈?duì)枀^(qū)域的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。瀕死蝦的主要癥狀：甲殼有白色不透明的斑塊，壞死，體色淡藍(lán)色，食欲不振，肌肉發(fā)白。
 
　　2.2 疾病爆發(fā)時(shí)的水質(zhì)和理化參數(shù)
　　對(duì)發(fā)病池塘水取樣，對(duì)水質(zhì)參數(shù)，包括鹽度、溶解氧（DO）、pH值、堿度（alkalinity）、硬度（hardness）、氨氮，按照巴斯卡蘭（1964）的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，如表1。




　　2.3 細(xì)菌分離
 
　　2.4 篩選WSSV
 
　　2.5 致病因素
　　2.5.1 累積死亡率
　　為了研究致病細(xì)菌病原體的毒力，對(duì)南美白對(duì)蝦的仔蝦、成蝦和鹵蟲成蟲進(jìn)行病原微生物感染實(shí)驗(yàn)。
    2.5.2 細(xì)胞外毒力因子
　　蛋白水解活性、溶血活性、明膠酶檢測(cè)、脂肪酶檢測(cè)。
    
　　2.6 細(xì)菌鑒定方案
    2.6.1 表型鑒定
    2.6.2 蝦組織樣本革蘭氏染色
    
　　2.7 數(shù)據(jù)分析
　　P≤0.001，顯著。

　　3、結(jié)果
    
　　3.1 感染蝦的病理變化
　　在南美白對(duì)蝦感染白斑病的前期，每天的死亡緩慢增加，但其攝食率較高。感染蝦的臨床癥狀是：（一）尾部橫紋肌和腹部肌肉組織壞死；（二）壞死的區(qū)域表現(xiàn)為白色不透明的斑塊。之后，白色的斑塊變成黑色斑點(diǎn)或者碎片；（三）蝦體色變成淡藍(lán)色；（四）食欲不振；（五）有時(shí)候體表粗糙，體色變紅或不變色；（六）肌肉發(fā)白；（七）許多死蝦顯示，其外部骨骼完整，但內(nèi)部組織卻缺失了很多，就好像是被吃了或者是內(nèi)部退化造成的。在疾病急性發(fā)生期，南美白對(duì)蝦的死亡率高達(dá)70%（圖1）。

圖1 由細(xì)菌引起的太平洋南美白對(duì)蝦白斑病（WPD）大規(guī)模爆發(fā)，箭頭表示甲殼上的白斑。


　　3.2 細(xì)菌分離
　　每個(gè)池塘均分離出了4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌種，它們分別命名為：池塘-I的為PI-1、PI-2、PI-3和PI-4；池塘-II的為PII-1、PII-2、PII-3和PII-4；池塘- III的為PIII-1，PIII-2，PIII-3和PIII。鑒定知：菌落的PI-3，PII-2和PIII-2具有相同的形態(tài)。分離鑒定從每個(gè)池塘中挑選10尾蝦進(jìn)行分離（表2）。

右上角標(biāo)a的蠟樣芽孢桿菌在所有篩選出來(lái)的蝦上均分離出了

　　3.3篩選WSSV
　　對(duì)感染白斑病的蝦進(jìn)行DNA的PCR擴(kuò)增，從三個(gè)池塘取樣的蝦，其結(jié)果均為陰性（見(jiàn)表3）。



　
　　3.4 致病因子的研究
　　南美白對(duì)蝦成蝦、仔蝦和鹵蟲感染從白班病中分離的不同細(xì)菌，導(dǎo)致的累積死亡率見(jiàn)表4。細(xì)菌感染蝦和鹵蟲時(shí)，PI-3、 PII-2和 PIII-3能夠有效的殺死它們。用PI-3感染仔蝦、成蝦和鹵蟲時(shí)，其累積死亡率分別為92.4%、100% 和100%。而PII-2感染時(shí)，則分別為96.6%、 100 %和 98.50 %。但PIII-2感染時(shí)，其死亡率（95％至100％）更高。單因素方差分析結(jié)果表明，對(duì)蝦和鹵蟲感染，其結(jié)果在不同的細(xì)菌間差異顯著（P≤0.001）。



　　用10 8 cfu /ml 的從白斑病分離的細(xì)菌感染仔蝦、成蝦和鹵蟲后的累積死亡率。右上表字母相同表示差異不顯著（單因素方差分析）。

　　3.5 疑似細(xì)菌性病原體鑒定
　　3.5.1 表型鑒定
　　結(jié)果表明，被鑒定的細(xì)菌（PI-3，PII-2和PIII-2）為革蘭氏陽(yáng)性菌，游動(dòng)，能夠形成內(nèi)生孢子，對(duì)甲基紅、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、淀粉水解、氧化酶試驗(yàn)、酪氨酸瓊脂和酚紅葡萄糖溶液等呈陽(yáng)性；它們對(duì)伏-伯氏檢測(cè)、吲哚生產(chǎn)、檸檬酸利用率、尿素酶試驗(yàn)和硝酸鹽還原等呈陰性。這三株菌株都有分解碳水化合物，抵抗溶酶菌，產(chǎn)生溶血毒素的能力。根據(jù)形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定，確定這三株細(xì)菌為同一種蠟樣芽孢桿菌（表5）。



　　3.5.2 蝦組織樣本的革蘭氏染色
　　革蘭氏染色的結(jié)果表明，圖2的a和b顯示，在感染了白斑病蝦的尾部腹肌中可以清楚的看到桿狀的革蘭氏陽(yáng)性菌。

40×放大倍數(shù)，箭頭指示桿狀菌


　　3.5.3 基因水平鑒別致病菌病原體
　　NCBI BLAST搜索分析表明，該WPD致病病原體與蠟樣芽孢桿菌相符。其16S rRNA基因序列，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，WPD致病蠟樣芽孢桿菌與其它蠟樣芽孢桿菌的同源性為98%，如B.cereus IAM。WPD致病蠟樣芽孢桿菌與其它同源性較高的蠟樣芽孢桿菌依次為Y-TSB18、BAB2832、XX2010，等（圖3）。WPD致病蠟樣芽孢桿菌序列已經(jīng)被收錄在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)了，GenBank中其名稱為白斑病（WPD）蠟樣芽孢桿菌，登錄號(hào)為KF673474.1。




　　4、討論
           
　　2012年，白斑病的危害在印度的南部—安德拉邦發(fā)生的很緩慢。到了2013年，它已經(jīng)蔓延到了安德拉邦的其它區(qū)域，包括內(nèi)洛爾，Prakasam，Gundur，克里希納， West Kodavari and East Kodavari區(qū)域。也蔓延到泰米爾納德邦的納格伯蒂訥姆，Sirkali，Cudalore，Velankanni，Pudhukottai區(qū)域。目前，在安得拉邦和泰米爾納德邦的南美白對(duì)蝦半精養(yǎng)養(yǎng)殖場(chǎng)爆發(fā)了該疾病。此前（即2012年），僅在夏季爆發(fā)白斑病導(dǎo)致死亡。后來(lái)在2014年的冬天和夏天均爆發(fā)了此病。另外，在本研究中，白斑病導(dǎo)致的癥狀中，首先出現(xiàn)的是尾部橫紋肌肌肉組織壞死，壞死的區(qū)域表現(xiàn)為白色不透明的斑塊。之后，白色的斑塊變成黑色斑點(diǎn)或者碎片。Wang et al. (2000)做了一些工作，他發(fā)現(xiàn)，在馬來(lái)西亞半島的斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，枯草芽孢桿菌導(dǎo)致了細(xì)菌性白班綜合癥（BWSS）。被感染的蝦上面有類似于白班綜合癥（WSSV）引起的白色斑點(diǎn)，還有大量的桿狀細(xì)菌存在。
          
　　在本研究中，從三個(gè)不同的池塘分離出12株細(xì)菌，分別進(jìn)行毒力研究，以確定南美白對(duì)蝦的真正致病源。從每個(gè)池塘取10尾蝦進(jìn)行WSSV檢測(cè)，均成陰性。在30尾實(shí)驗(yàn)蝦中（來(lái)自三個(gè)池塘），均檢測(cè)到了芽孢桿菌屬的細(xì)菌（PI-1，PII-2和PIII-3），后來(lái)證實(shí)引起白斑病（WPD）的是蠟樣芽孢桿菌。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，細(xì)菌PI-1，PII-2和PIII-3具有較高的毒力，在3天內(nèi)能夠有效的殺死實(shí)驗(yàn)蝦和鹵蟲。對(duì)蝦肌肉的革蘭氏染色結(jié)果證實(shí)，在WPD病蝦橫紋肌中有革蘭氏陽(yáng)性桿菌。基于這些結(jié)果，細(xì)菌PI-1，PII-2和PIII-3被確定為WPD的致病原。Wang et al. (2000)早期的工作也證明，枯草芽孢桿菌導(dǎo)致了斑節(jié)對(duì)蝦的細(xì)菌性白班綜合癥（BWSS），它是通過(guò)顯微鏡和PCR研究確定的。
          　
　　本研究中，PI-1，PII-2和PIII-3具有較高的蛋白水解，溶血，明膠酶和脂酶活性。這表明它們具有裂解蝦角質(zhì)層的能力，其角質(zhì)層由蛋白，殼多糖，碳酸鈣和脂質(zhì)構(gòu)成（Branson, 1993;Dennell, 1960）。患WPD的蝦，其甲殼上有白色不透明的斑塊。之后，白色的斑塊變成黑色斑點(diǎn)或者碎片，最后粗糙不平。蠟樣芽孢桿菌是一個(gè)重要的食源性產(chǎn)腸毒素的致病菌，已經(jīng)從魚的樣品中分離出來(lái)了，并找到了其負(fù)責(zé)毒力的基因(Das et al.,2009)。枯草芽孢桿菌被報(bào)道為分泌多種酶，主要是蛋白酶，淀粉酶，葡聚糖酶和脂肪酶(Formigoni et al., 1997; Shady, 1997)。Hendriksen et al. (2006)證明，土壤沉積物中蠟樣芽孢桿菌的豐度存在hlyII基因。在其有天然宿主且溫度條件適宜時(shí)，hlyII基因表達(dá)毒力因子。在我們的研究中，可能是環(huán)境條件不利導(dǎo)致的疾病爆發(fā)。不利環(huán)境下，溶血因子直接通過(guò)且表達(dá)。Andreeva et al. (2007)指出， hlyII基因表達(dá)和作用的最佳溫度為15至28℃。hlyII基因它可在甲殼動(dòng)物體內(nèi)作用(Sineva et al. 2009)。
          
　　根據(jù)表型和基因組水平鑒定WPD的致病病原體（PI-1，PII-2和PIII-3），被確認(rèn)為蠟狀芽孢桿菌，并收錄在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank登錄號(hào)：KF673474.1）。基于上述的鑒定和分子表征，蠟樣芽孢桿菌是普遍存在的桿狀內(nèi)生孢子增殖(De Jonghe et al., 2008)，它廣泛存在于環(huán)境中，包括土壤和粘土、沙、塵、礦物水、加工過(guò)的食品等(Goepfertetal.,1972;Johnson,1984;Norris et al., 1981)。昆蟲的腸道被建議為蠟樣芽孢桿菌棲息地，其孢子可以在里面萌發(fā)成蠟樣芽孢桿菌。之后，從土壤節(jié)肢動(dòng)物的腸道內(nèi)分離并鑒定出了蠟樣芽孢桿菌(Margulis et al., 1998)。基于蝦組織革蘭氏染色、毒力因子、表型、基因組水平鑒定，得出的結(jié)果是：導(dǎo)致南美白對(duì)蝦白斑病WPD的致病原為蠟樣芽孢桿菌。