技術(shù)概述：

　　我國(guó)養(yǎng)殖蝦類產(chǎn)量在2008年達(dá)到198萬噸，占世界總產(chǎn)量的40%以上，對(duì)蝦病毒病爆發(fā)給我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成損失在50億元以上;開展對(duì)蝦苗種病毒檢測(cè)是避免病毒病大規(guī)模爆發(fā)流行減少損失的重要途徑。

　　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)是2000年由Notomi 等發(fā)明的一種全新的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。通過開展LAMP技術(shù)檢測(cè)對(duì)蝦病毒的研究，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所成功開發(fā)出實(shí)用性強(qiáng)、特異性高的對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)、桃拉綜合征病毒(TSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、肝胰腺細(xì)小病毒(HPV)、斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒(MBV)、黃頭病毒(YHV)、傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)、羅氏沼蝦諾達(dá)病毒(MrNV)、凡納濱對(duì)蝦諾達(dá)病毒(PvNV)、對(duì)蝦桿狀病毒(BP)等十多種蝦類病毒的系列核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù);同時(shí)，通過研發(fā)核酸快速制備、染料固定化等配套技術(shù)，目前已經(jīng)建立了上述病毒的現(xiàn)場(chǎng)快速高靈敏檢測(cè)技術(shù)并研發(fā)生產(chǎn)了相關(guān)檢測(cè)試劑盒。

　　此技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)：

　　(1)靈敏度高，對(duì)病毒的檢測(cè)可低至10個(gè)拷貝，其靈敏度比普通PCR方法高100倍以上;

　　(2)特異性強(qiáng)，所用的檢測(cè)引物均是依據(jù)病毒保守基因中6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)，特異性超過常規(guī)PCR;

　　(3)檢測(cè)時(shí)間短，從核酸制備到檢測(cè)完成只需1個(gè)小時(shí);

　　(4)儀器要求寬松，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，只要一個(gè)水浴鍋或金屬浴，甚至一暖壺開水和一個(gè)溫度計(jì)就能完成檢測(cè)反應(yīng)。

　　(5)操作簡(jiǎn)單、結(jié)果明顯。整個(gè)檢測(cè)過程不涉及復(fù)雜儀器或設(shè)備，稍具分子生物學(xué)基礎(chǔ)的人員即可完成操作;檢測(cè)結(jié)果清晰明顯，直接用眼睛觀察就可以判斷。

　　(6)對(duì)人和環(huán)境安全。檢測(cè)過程中不使用有毒試劑，對(duì)人和環(huán)境都非常安全。

　　(7)低成本。 LAMP檢測(cè)總成本大大低于現(xiàn)有最廉價(jià)的PCR檢測(cè)方法。

　　目前，該項(xiàng)技術(shù)已申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利20項(xiàng)，獲得授權(quán)14項(xiàng)。

　　增產(chǎn)增效情況：目前，利用上述檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)完成了對(duì)來自遼寧、天津、河北、山東、江蘇、浙江、福建、廣東、廣西等省市的800多份對(duì)蝦樣品的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法比PCR檢測(cè)方法具有更高的靈敏度和可靠性。并且，該檢測(cè)技術(shù)不涉及有毒的試劑，對(duì)操作人員健康和環(huán)境保護(hù)都非常友好;與之前對(duì)蝦病毒檢測(cè)技術(shù)相比，該項(xiàng)技術(shù)除對(duì)儀器設(shè)備無特殊要求外，還能使檢測(cè)成本降低50%以上。

　　技術(shù)要點(diǎn)：

　　1.取對(duì)蝦個(gè)體(仔蝦、幼體和幼蝦)或?qū)ξr鰓絲或附肢(成蝦)樣品約磨碎至漿狀;

　　2.用牙簽蘸取漿狀的樣品分別采樣用膜片充分潤(rùn)濕;

　　3.用吸管吸取A液，滴于的采樣用膜片上;

　　4.取新牙簽將上述采樣用膜片漂洗3~4 分鐘;

　　5.采樣用膜片、陽性及陰性對(duì)照膜片于95℃保溫4 分鐘，迅速置于冷水中2分鐘;

　　6.將上述膜片轉(zhuǎn)入反應(yīng)液中57~60 ºC保溫50分鐘;

　　7.將反應(yīng)液于90~95 ºC保溫2分鐘;

　　8.觀察反應(yīng)液顏色，如果顯示綠色則表示該樣品的病毒檢測(cè)結(jié)果為陽性，如果顯示橙黃色則表示該樣品的病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性。

　　適宜區(qū)域：適于在現(xiàn)場(chǎng)、水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)、相關(guān)各級(jí)實(shí)驗(yàn)室使用，尤其能夠滿足技術(shù)力量相對(duì)薄弱的對(duì)蝦育苗、養(yǎng)殖單位開展現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。

　　注意事項(xiàng)：

　　1.因該檢測(cè)技術(shù)的靈敏度非常高，所以檢測(cè)過程應(yīng)嚴(yán)格按照操作指南進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后不能打開擴(kuò)增檢測(cè)管，以防反應(yīng)產(chǎn)物濺出污染后續(xù)檢測(cè)樣品導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。

　　2.黑色背景更利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，可利用試劑盒說明書中提供的黑色背景進(jìn)行觀察。

　　技術(shù)依托單位：中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所